甘蓝型油菜乙酰转移酶基因的克隆及功能验证（三）

2.5.2 转148基因T1种子脂肪酸成分分析

分别收集野生型拟南芥(对照)、甘蓝功148基因过表达(35s-148)与RNAi干扰(148R)转基因T1种子,型油酰转烘干后用气相色谱仪测定各脂肪酸含量,用Excel2019单因素方差分析法分析各个脂肪酸成分,结果见表6。

由表6可知,菜乙与野生型拟南芥种子脂肪酸各成分相比,干扰148基因(148R)会导致油酸含量增加,幅度为31.19%,而软脂酸、亚麻酸会极显著减少,移酶验证而花生烯酸含量显著减少,减少幅度分别为5.46%,18.68%,13.16%,并使硬脂酸增加,亚油酸和芥酸减少,但是增减幅度没有达到显著水平,干扰148基因还会导致芥酸含量增加；过表达148基因(35s-148)会导致软脂酸、油酸、基因亚油酸含量的隆及极显著增加,其增加幅度分别为23.50%,45.12%，14.03%,甘蓝功而硬脂酸、亚麻酸和花生烯酸的型油酰转含量与野生型拟南芥相比,都有极显著的下降。

在对饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸分析中,菜乙干扰148基因会使饱和脂肪酸含量下降,对不饱和脂肪酸无显著影响；过表达148基因会显著增加不饱和脂肪酸的含量,而对饱和脂肪酸无显著影响。

2.5.3 对具有相同变化趋势的移酶验证脂肪酸成分进行分析

结合表5,6,选取在2个拷贝基因的过表达与干扰体系中,脂肪酸成分具有相同变化趋势的油酸、亚麻酸、基因花生烯酸和芥酸,隆及并进行方差分析,结果见表7。

结果显示,甘蓝功过表达114基因会导致花生烯酸极显著的下降,而对其他脂肪酸含量无显著影响；干扰148基因会导致芥酸含量的极显著增加,而对其他脂肪酸成分无显著影响。

3 讨论与结论

棕榈酸是型油酰转游离脂肪酸中最主要的饱和脂肪酸,能够诱导肝细胞、骨骼肌和心肌细胞等发生胰岛素抵抗,菜乙硬脂酸是自然界广泛存在的一种脂肪酸,在动物脂脉中的含量较高,植物油中含量较少,主要应用于橡胶和化妆品工业,人若长期微量摄入可能会刺激眼睛、呼吸系统。油酸是人体最易消化吸收的脂肪酸,高油酸具有降低人体血液中有害的低密度脂,同时可减少血浆中脂蛋白胆固醇含量,有效的预防及治疗动脉的硬化。亚油酸是一种人体必需脂肪酸,在机体内含量极为丰富,具有降血脂、降血压、防止动脉硬化,还参与了人体物质循环和免疫调节。x-亚麻酸是二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)的前体物质,EPA和DHA在视网膜和大脑的结构膜中也起重要作用,亚麻酸还具有抗动脉粥样硬化、预防心脑血管疾病及减肥、降血脂等生理功能。花生四烯酸具有增加血管弹性、酯化胆固醇,调节血细胞功能等一系列生理活性,对预防心血管疾病、糖尿病和肿瘤等具有重要功效。花生四烯酸及其代谢产物还参与了人体造血和免疫调节,花生四烯酸降低血液中胆固醇的效果是亚油酸和亚麻酸的4倍,其降低血液中血脂和血压的能力也要强于亚油酸和亚麻酸。芥酸在人体内不易被消化吸收,而且芥酸凝固点高,不适于食品加工。高芥酸的油菜籽饼粕需经过脱毒处理才能用作动物饲料,因此,降低芥酸含量是油菜食用目的脂肪酸改良的首要任务。

在西方饮食中,棕榈酸(C16∶0)和硬脂酸(C18∶0)是最常食用得饱和脂肪酸。一般认为棕榈酸比硬脂酸更能提高胆固醇,世界卫生组织(WHO)与联合国粮农组织(FAO)曾建议食用油中饱和脂肪酸∶单不饱和脂肪酸∶多不饱和脂肪酸=1∶1∶1。熊秋芳等分析认为,在亚麻酸质量分数不低于5%的前提下,饱和脂肪酸含量越低、油酸含量越高、且ω-6与ω-3比例为1～4∶1的天然食用植物油品最具营养价值。

拟南芥作为模式植物,并与甘蓝型油菜同属于芸薹属十字花科且有着共同的原始祖先,开展拟南芥研究可为甘蓝型油菜研究提供重要参考与借鉴。

本研究对克隆得到的AT基因的2个拷贝进行生物信息学分析,发现114与148同属于酰基转移酶模型,但其构象略有不同，推测其在甘蓝型油菜中发生了序列变异,将进一步研究；脂肪酸组成分析表明,乙酰转移酶基因的这2个拷贝在饱和脂肪酸的代谢过程中具有相同的功能,过表达114基因与148基因均会导致软脂酸含量的增加,硬脂酸含量的减少,干扰114基因与148基因均会导致软脂酸含量的减少,硬脂酸含量增加,表明在软脂酸向硬脂酸合成过程中发挥抑制作用，抑制这2个拷贝表达,可以促进软脂酸向硬脂酸转化；这2个拷贝在不饱和脂肪酸代谢过程中存在差异,过表达114基因和148基因均会引起亚油酸含量的增加，而通过分析其他几个具有相同变化趋势的脂肪酸成分后,发现可以通过过表达114基因,可以使花生烯酸含量显著下降,干扰148基因的表达会导致芥酸含量的增加。这2个拷贝可以促进菜籽油品质改良。

本研究以前期对高亚麻酸油菜近等基因系材料miRNA测序结果为基础,同源克隆获得了AT基因的2个拷贝114与148(均为1350bp),分别构建了这2个基因的翅表达载体和RNAi干扰载体并成功转化拟南芥。生物信息学分析表明,114编码的蛋白偏中性而148编码的蛋白偏碱性,114与148均为稳定蛋白,亲水性差,属于脂溶性蛋白，且定位在细胞质,无跨膜结构。114基因与148基因在脂肪酸代谢途径中,抑制软脂酸向硬脂酸转化。过表达114基因和与148基因可以提高不饱和脂肪酸含量,抑制这2个拷贝基因会导致饱和脂肪酸含量的增加；过表达114基因可以显著增加软脂酸、油酸和亚油酸的含量,并减少硬脂酸、亚麻酸和花生烯酸的含量,干扰114基因的表达可以增加硬脂酸和油酸的含量,减少软脂酸、亚油酸和亚麻酸的含量；过表达148基因可以增加软脂酸、油酸和亚油酸的含量，减少硬脂酸、亚麻酸和花生烯酸的含量,而干扰148基因会导致油酸、花生烯酸以及芥酸含量的增加,软脂酸亚油酸和亚麻酸含量的减少；可以通过过表达114基因,促使花生烯酸含量的下降,干扰148基因的表达会导致芥酸含量的增加。因此,乙酰转移酶基因这2个拷贝对改良甘蓝型油菜脂肪酸成分作用明显。

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